Cuando DAPI se une a ADN bicatenario su máximo de absorción es a una longitud de onda de 358 nm (ultravioleta) y de su máximo de emisión es a 461 nm (azul). Por lo tanto en la microscopía de fluorescencia DAPI es excitado con luz ultravioleta para después ser detectado a través de un filtro azul / cian. DAPI también puede unirse a RNA, Sin embargo, aunque su pico de emisión es bastante amplio no es tan fluorescente. Su emisión se desplaza a alrededor de 500 nm cuando se une a ARN.

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