Cromatografía líquida

La Cromatografía líquida, también conocida como Cromatografía de líquidos, es una técnica de separación y no debe confundirse con una técnica cuantitativa o cualitativa de análisis. Es una de las técnicas analíticas ampliamente utilizada, la cual permite separar físicamente los distintos componentes de una solución por la absorción selectiva de los constituyentes de una mezcla. En toda cromatografía existe un contacto entre dos fases, una fija que suele llamarse fase estacionaria, y una móvil (fase móvil) que fluye permanente durante el análisis, y que en este caso es un líquido o mezcla de varios líquidos. La fase estacionaria por su parte puede ser alúmina, sílice o resinas de intercambio iónico que se encuentran disponibles en el mercado. Los intercambiadores iónicos son matrices sólidas que contienen sitios activos (también llamados grupos ionogénicos) con carga electrostática (positiva o negativa). De esta forma, la muestra queda retenida sobre el soporte sólido por afinidad electrostática. Dependiendo de la relación carga/tamaño unos constituyentes de la mezcla serán retenidos con mayor fuerza sobre el soporte sólido que otros, lo que provocará su separación. Las sustancias que permanecen más tiempo libres en la fase móvil, avanzan más rápidamente con el fluir de la misma y las que quedan más unidas a la fase estacionaria o retenidas avanzan menos y por tanto tardarán más en salir o fluir. Éste es el principio fundamental de la cromatografía. Un ejemplo notable es la cromatografía de intercambio iónico. Las columnas más utilizadas son las de sílice.

Métodos de cromatografía líquida

Método	Abreviatura	Mecanismo predominante
Líquido, sólido o de adsorción	LSC	Adsorción sobre la superficie
Líquido	LLC	Reparto entre fases líquidas, una móvil y la otra estacionaria.
Fase enlazada	BPC	Reparto y / o adsorción entre las fases móvil y enlazada.
Pares de iones	IPC	Separación de pares de iones entre las fases móvil y enlazada.
Intercambio iónico	IEC	Uso de la carga por adsorción sobre un sitio iónico fijo por medio de intercambio de cationes o de aniones.
Exclusión estérica	EC	Aprovechamiento del tamaño de las moléculas por su difusión dentro de poros de tamaño adecuado.
Afinidad	--	Uso de la estructura de ligantes inmovilizados para unir bioselectivamente la proteína deseada.

Selección de un método de cromatografía líquida

El conocimiento de la estructura molecular de los componentes de la muestra puede ser muy útil en la selección de un método de cromatografía líquida. Una guía muy general para la selección de un método se da a continuación.

La cromatografía de adsorción opera mejor en la separación por clases de compuestos o para la separación de compuestos isoméricos. La técnica de cromatografía líquido – líquido es mejor para la separación de homólogos. Los grupos funcionales que son capaces de formar enlaces de hidrógeno fuertes se retienen mucho en cromatografía de adsorción, sin embargo la CLL(Líquido – líquido) proporciona una alternativa para la separación de estos compuestos, estas serán las muestras que tienen polaridad media y son solubles en disoluciones orgánicas débilmente polares, en general en CLL se logra emparejando la polaridad de la fase estacionaria con la de la muestra y utilizando una fase móvil con una polaridad marcadamente diferente.

La más utilizada es la de fase enlazada, BPC, Reparto y/o adsorción entre las fases móvil y enlazada, y en especial la fase reversa (especialmente la C18) pues permite separar tanto compuestos con cierta apolaridad como compuestos iónicos mediante el uso de la técnica de supresión de la ionización o de la cromatografía de par iónico dependiendo del pH de máxima estabilidad de la columna.

Los grupos iónicos y los ionizables sugieren el uso de la cromatografía de intercambio iónico o de pares de iones cuando la muestra es soluble en agua y los pesos moleculares son menores de 2000 daltons.

Cuando se sabe o se sospecha que el peso molecular excede de 2000 daltons para alguno o todos los componentes de la muestra, entonces es indicado el uso de cromatografía de exclusión (permeación en gel). Este método se basa en la actitud de los sustratos de porosidad controlada para clasificar y separar muestras de mezclas de acuerdo al tamaño y forma molecular.

Un procedimiento cromatográfico adicional depende de la estructura de los solutos considerada como un todo y no como función de grupos funcionales específicos o de la carga y el tamaño. La cromatografía de afinidad utiliza especies bioquímicas inmovilizadas como fase estacionaria para separar uno o algunos solutos de entre cientos de ellos que no se retienen. Las separaciones explotan el enlace de cerradura y llave que prevalecen en los sistemas biológicos.

Véase también

• Cromatografía de intercambio iónico