Amplificación Qβ
La amplificación Qβ es una técnica genética basada en la amplificación de una sonda específica que se une a la secuencia de interés (en vez de la habitual que amplifica la secuencia, como en otros métodos). Esto se realiza gracias a la enzima Qβ replicasa, que es una ARN polimerasa dependiente de ARN del bacteriófago Qβ. Esta reconoce una estructura terciaria de ARN metaestable.
Mediante este método se puede amplificar ARN y ADN de cadena simple.
Bacteriófago Qβ[editar]
Se descubrió en 1917 por Félix d'Herelle. Es un virus RNA de la familia Leviviridae, que pertenece al grupo III de género Alolevivirus. Tiene una cápsida icosaédrica de simetría T=3, con un tamaño de 25 nm de diámetro. Su material genético está formado por una molécula de RNA de cadena sencilla (ssRNA) y polaridad positiva pudiendo actuar como mRNA.
![](http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/a/a0/Mapa_gen%C3%A9tico_del_ADN_del_bacteri%C3%B3fago_Q%CE%B2.png/250px-Mapa_gen%C3%A9tico_del_ADN_del_bacteri%C3%B3fago_Q%CE%B2.png)
Su genoma contiene 4217 nucleótidos y codifica para 4 proteínas[1][2]
La proteína A2, codificada por la región comprendida entre los nucleótidos 61-1320, es necesaria para la formación de nuevos viriones y está implicada en la lisis celular.
El gen que codificado entre los nucleótidos 1344-1742 es la proteína de la cápsida, que si se lee mal da lugar a una proteína denominada A1 o readthrough con 588 nucleótidos adicionales-[3][4] Para terminar, el gen que codifica la enzima replicasa se encuentra desde el nucleótido 2352 al 4118.
Las poblaciones de este bacteriófago no contienen una secuencia única y definida, sino que tienen un gran número de cuasiespecies.[5]
![](http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/9/99/Ciclo_viral_del_bacteri%C3%B3fago_Q%CE%B2.png/250px-Ciclo_viral_del_bacteri%C3%B3fago_Q%CE%B2.png)
El ciclo de infección del bacteriófago Qβ comprende tres procesos:[6][7][8]
- Adsorción a la célula hospedadora.
- Síntesis de nuevas moléculas de RNA y proteínas virales.
- Liberación de la progenie viral.
Método de amplificación[editar]
Se emplean dos tipos de sondas:
- Sonda señalizadora: Se unirá solo una sonda por molécula de genoma viral y ésta se diseña partiendo de la estructura de ARN metaestabe que es reconocida por la replicasa Qβ.
- Sonda de captura: Tendrá una secuencia complementaria a la diana y en unos de os extremos se le colocará una cola poliG.
1. Se realiza la hibridación de las dos sondas con la diana.
![](http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/a/a8/Paso_1_Amplificaci%C3%B3n_Q%CE%B2.png/250px-Paso_1_Amplificaci%C3%B3n_Q%CE%B2.png)
2. Se fija mediante una bola magnética que contiene una cola poliC, que se unirá por complementariedad a la cola poliG de la sonda de captura.
3. Se llevarán a cabo varios lavados para eliminar el exceso de sodas de captura y señalizadora en el medio y conseguir así que solamente haya secuencia metaestable unida a la diana.
4. Se utiliza la enzima Qβ replicasa para amplificar así la sonda señalizadora generándose aproximadamente 106-109 copias por sonda señalizadora en unos 15 minutos.
5. Detección y cuantificación por colorimetría o fluorescencia en tiempo real.
Ventajas frente a otros métodos de amplificación[editar]
- No es necesario el uso de termociclador.
- El tiempo es muy reducido.
- Replicación muy eficiente (10^6 - 10^9 copias por molécula original en menos de 15 minutos).
- Sensibilidad y especificidad altas, siempre que se realicen correctamente los lavados.
- El costo es mucho menor que el de otras técnicas.
Inconvenientes[editar]
Suele dar falsos positivos: La cubeta tiene problemas de especificidad si no se lava bien, ya que en la limpieza de la misma con el imán, puede quedarse una sonda de ARN metaestable sin unirse y dar positivo.
Véase también[editar]
Referencias[editar]
- ↑ Weissmann, C. (1974). «The making of a phage». FEBS Lett. 40 (0): S10-18.
- ↑ Weissmann, C.; Billeter, M.A.; Goodman, H.M.; Hindley, J.; Weber, H. (1973). «Structure and function of phage RNA». Annu. Rev. Biochem 42: 303-329.
- ↑ Hofstetter, H., H.; Monstein, H.J.; Weissmann, C. (1974). «The read-through protein A1 is essential for the formation of viable Qβ particles». Biochim. Biophys. Acta 374: 238-251.
- ↑ Weiner, A.M.; Weber, K. (1971). «Natural read-through at the UGA termination signal of the Qβ coat protein cistron». Nature New Biol. 234: 206-209.
- ↑ Domingo E., Sabo D.L., Taniguchi T., Weissmann C. (1978). «Nucleotide sequence heterogeneity of an RNA phage population». Cell 13: 735-744.
- ↑ a b Cabanillas L. (2015). «Caracterización de los mecanismos de resistencia a 5-azacitidina en el bacteriófago Qβ». Departamento de Microbiología, Facultad de Ciencias, Universidad Autónoma de Madrid.
- ↑ García-Villada, L., Drake, J.W. (2013). «Experimental selection reveals a trade-off between fecundity and lifespan in the coliphage Qβ.». Open Biol. 3: 130043.
- ↑ Tsukada, K., Okazaki, M., Kita, H., Inokuchi, Y., Urabe, I., and Yomo, T. (2009). «Quantitative analysis of the bacteriophage Qβ infection cycle». Biochimica et Biophysica Acta 1790: 65-70.
Bibliografía[editar]
- Weissmann, C. (1974). The making of a phage FEBS Lett 40(0):S10-8.
- Hofstetter, H., Monstein, H.J., and Weissmann, C. (1974). The read-through protein A1 is essential for the formation of viable Qβ particles. Biochim, Biophys, Acta 374:238-251.
- Domingo E., Sabo D.L., Taniguchi T., and Weissmann C. (1978). Nucleotide sequence heterogeneity of an RNA phage population. Cell 13:735–44.
- García-Villada, L., and Drake, J.W. (2013). Experimental selection reveals a trade-off between fecundity and lifespan in the coliphage Qβ. Open Biol. 3: 130043.
- Axelrod, V.D., Brown, E., Priano, C., and Mills, D.R. (1991). Coliphage Q beta RNA replication: RNA catalytic for single-strand release. Virology 184(2):595-608.