La Temporada 2000-2001 de la Segunda División de Venezuela comenzó el 18 de febrero de 2000, con la participación de 9 equipos. El equipo que finalizó en primera posición logró el ascenso a la Primera División de Venezuela para la siguiente temporada, mientras que el segundo lugar disputó la serie de promoción/relegación contra el penúltimo de la tabla acumulada del torneo de Primera División.
El Portuguesa FC logra el ascenso a la Primera División de Venezuela para la temporada siguiente. El Monagas SC, a pesar de haber perdido la serie, pudo mantenerse en la Primera División para la siguiente temporada, tras ocupar el lugar de ULA FC, que se retiró por problemas económicos.