Usuario:A.CarmenSevilla/Taller

VIVO “sistema de detección in vivo de off-targets”

Introducción.

VIVO​ es un “sistema de detección in vivo de off-targets”. Esta herramienta es un método eficiente para la detección de las zonas de edición fuera de la región diana a la cual orientamos las guías RNA del sistema de edición genómica CRISPR /Cas .Actualmente es el único método que actualmente cuenta con una observación inicialmente in vitro de los posibles off-targets de las guías con una posterior comprobación in vivo de la acción real de las guías RNA.El sistema VIVO nos permite detectar y cuantificar las regiones fuera de la diana o "target" de las nucleasas, de esta forma se busca definir que generando una guía RNA bien diseñada esta carece de off-targets o mutaciones aleatorias.

Componentes de VIVO y aplicación.

El sistema VIVO se compone de dos etapas consecutivas:

a) CIRCLEseq​ : es un método in vitro para la determinación de los posibles off-targets que puede generar una RNA guía en unas células determinadas. Esta etapa se basa en la localización de regiones del DNA donde pueda producir un corte la Cas9 debido a que estas regiones son complementarias a los RNA guías diseñados. Esas regiones del DNA se cortan y se anillan, dando lugar a fragmentos circulares de DNA con regiones para el corte mediado por Cas9 y otras sin región reconocida por la Cas9 que se van a degradar mediante un tratamiento con exonucleasas. Los fragmentos circulares deseados se someten a una linealización mediante el uso de la Cas9 .Los fragmentos lineales adquieren un ligando adaptador, se someten a PCR y posteriormente se analizan mediante técnicas de secuenciación. Cada una de las secuencias obtenidas corresponderá a un posible off-target de la Cas9 mediante el uso de las guías diseñadas.

b) Comprobación in vivo: a partir de los datos obtenidos mediante CIRLCE seq se comprueba que realmente se produce un corte en esas regiones del DNA mediante la Cas9 in vivo .Para ello se utiliza un tejido al que se aplica las Cas9 y se observa si las regiones predichas por CIRCLE seq realmente se cortan por las nucleasas.