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Reactivo de Edman[editar]
La degradación de Edman, desarrollada por Pehr Edman en la década de los 50, es un método de secuenciación de aminoácidos en un péptido. En este método se derivatiza y separa el residuo amino-terminal, lo que permite identificar su naturaleza y obtener el siguiente con el grupo amino libre, para continuar con el siguiente ciclo de reacción. Cada residuo es consecutivamente aislado y derivatizado sin afectar a los enlaces peptídicos entre los otros residuos. Para esta secuenciación se requiere el reactivo de Edman, también denominado fenilisotiocianato o PITC.
Propiedades del reactivo[editar]
Este reactivo es un líquido de color amarillento muy tóxico, volátil y que se absorbe muy fácilmente por la piel y las mucosas.[1]
- Nombres alternativos: PITC / Isotiocianato de fenilo / Reactivo de Edman.
- Nombre químico: isotiocianatobenceno.
- Reactivo hacia: Aminas primarias (-NH2).
- Fórmula química: C7H5NS.
- Fórmula lineal: C6H5NCS.
- Número de CAS (designación numérica asignada a las sustancias químicas por el US Chemical Abstracts Service): 103-72-0
- Peso molecular: 135,19 g/mol.
- Forma: líquido transparente, entre incoloro y amarillo pálido.
Ficha de datos de seguridad[editar]
Clasificación de acuerdo con el Reglamento (CE) 1272/2008[editar]
- Toxicidad aguda, Oral (Categoría 3), H301
- Corrosión cutáneas (Sub-categoría 1B), H314
- Sensibilización respiratoria (Categoría 1), H334
- Sensibilización cutánea (Categoría 1), H317
- Palabra de advertencia: Peligro
Indicaciones de peligro:[editar]
| H301 | Tóxico en caso de ingestión. |
| H314 | Provoca quemaduras graves en la piel y lesiones oculares graves. |
| H317 | Puede provocar una reacción alérgica en la piel. |
| H334 | Puede provocar síntomas de alergia o asma, o dificultades respiratorias en caso de inhalación. |
Declaraciones de prudencia:[editar]
| P261 | Evitar respirar la niebla o los vapores. |
| P272 | Las prendas de trabajo contaminadas no podrán sacarse del lugar de trabajo. |
| P280 | Llevar guantes/ ropa de protección/ equipo de protección para los ojos/ la cara. |
| P303
P361 P353 |
EN CASO DE CONTACTO CON LA PIEL (o el pelo):
Quitar inmediatamente toda la ropa contaminada. Enjuagar la piel con agua. |
| P304
P340 P310 |
EN CASO DE INHALACIÓN: Transportar a la persona
al aire libre y mantenerla en una posición que le facilite la respiración. Llamar inmediatamente a un CENTRO DE TOXICOLOGÍA / médico. |
| P305
P351 P338 |
EN CASO DE CONTACTO CON LOS OJOS: Enjuagar
con agua cuidadosamente durante varios minutos. Quitar las lentes de contacto cuando estén presentes y pueda hacerse con facilidad. Proseguir con el lavado. |
Propiedades físicas:[editar]
| Estado físico | líquido |
| Color | Incoloro-amarillento. |
| Punto de fusión / punto de congelación | Punto/intervalo de fusión: -21 °C - lit. |
| Punto inicial de ebullición e intervalo de ebullición | 218 °C - lit. |
| Punto de inflamación | 88 °C - copa cerrada. |
| Solubilidad en agua | Insoluble. |
| Densidad | 1,13 g/cm3 a 20 °C. |
Mecanismo[editar]
El reactivo de Edman (fenilisotiocianato o PITC) reacciona con el aminoácido del extremo N-terminal de un polipéptido en condiciones alcalinas para la formación de feniltricarbamilo (PTC). El producto obtenido se trata con TFA, lo cual corta el residuo N-terminal y genera un derivado de tiazolinona. Se utiliza un solvente orgánico para convertir la tiazolinona-aminoácido al derivado de feniltiohidantoina (PTH) para después ser identificado por métodos cromatográficos. El método de secuenciación por degradación de Edman es utilizado en péptidos de 10 a 50 residuos de aminoácidos. Sin embargo, si se utiliza para la secuenciación de proteínas mayores a 50 residuos de aminoácidos, la degradación ya no es eficaz, por lo que la proteína se debe de fraccionar en segmentos más pequeños para que se pueda llevar a cabo.
La reacción química de Edman es un proceso cíclico que consta de tres pasos.
- El reactivo de Edman o fenilisotiocianato (PITC) se acopla al grupo amino N-terminal libre.
- El residuo N-terminal se corta mediante el uso de ácido, dejando intacta el resto de la cadena peptídica con un nuevo extremo N-terminal susceptible de iniciar un segundo ciclo.
- El derivado aminoacídico formado a partir del aminoácido cortado (anilinotiazolinona) es inestable y por ello, se introduce en un medio ácido para convertirse en el derivado PTH estable (feniltiohidantoina).
Actualmente, el análisis de cada uno de los aminoácidos separados del péptido inicial puede realizarse mediante cromatografías HPLC/MS [2]de fase inversa (cromatografía líquida de alta resolución acoplada a la espectrometría de masas), por hidrofobicidad (se comparan los tiempos de retención de los diferentes aminoácidos cortados con una muestra patrón), por espectrometría de masas MALDI-TOF, o por análisis de aminoácidos.[3]
Primeros usos ¿Cómo se hizo inicialmente?[editar]
En 1950, Pehr Victor Edman describió un método para poder llevar a cabo la secuenciación de péptidos por medio del uso de fenilisotiocianato (PTC por sus siglas en inglés)[4]. Durante sus experimentos, Edman empleó péptidos formados por 3 o 4 aminoácidos que eran calentados a 40ºC y, sumergidos en una mezcla de agua-piridina con un pH básico (pH 9) gracias a la adición de hidróxido de sodio. En estas condiciones agregó PTC y tras media hora se había formado la unión entre el péptido y el fenilisotiocianato, sustrayendo el exceso de PTC y la piridina por extracciones con benceno. El péptido feniltiocarbamilado se separó y se disolvió posteriormente en un medio anhídrido (nitrometano) saturado con ácido clorhídrico hasta pH 3. Estas condiciones provocaron la ruptura del enlace peptídico entre el primer y el segundo aminoácido desde el extremo N-terminal, distinguiéndose una fase sólida (el péptido con un aminoácido menos que precipita debido a la presencia del HCl) y otra fase líquida (el PTC unido al aminoácido, que forman feniltiohidantoína o PTH), que se separan por filtración.
La solución del nitrometano se evaporó hasta sequedad a presión reducida y se añadió ácido acético glacial caliente para retirar las impurezas restantes de otros procesos. Al añadir agua y enfriar, se obtuvo PTH puro que cristaliza y se realizó una recristalización a partir de etanol puro, midiendo su punto de fusión para observar el grado de pureza. Al PTH se le agregó una disolución de hidróxido de bario que provocó su hidrólisis alcalina. Para retirar el bario, se aplicó una corriente de dióxido de carbono, apareciendo un precipitado de carbonato de bario en la disolución y otro de sal de PTC. Se retiraron estas dos especies en estado sólido por filtración tras aumentar la temperatura de la disolución para garantizar la solubilidad del aminoácido. Este aminoácido se sometió a una cromatografía en papel para determinar de qué aminoácido se trataba.
El resto de la cadena polipeptídica extraída en fase sólida se sometió a nuevos ciclos de degradación de Edman para obtener la secuencia de aminoácidos de la proteína.[5]
Limitaciones[editar]
No es posible secuenciar péptidos cuyo extremo N-terminal se encuentre bloqueado (grupo amino acetilado, formilado, etc). Alrededor del 50% de las proteínas tienen el extremo amino bloqueado, bien por naturaleza o por su preparación, en tampones con sustancias susceptibles de reaccionar con este. (cianato, ácido acrílico, acetilo, aldehído...). Otra limitación de la degradación de Edman es que el rendimiento no es del 100% y por tanto, cuando ya se llevan hechos muchos ciclos (más de 50 aminoácidos analizados), se obtienen errores.
Referencias[editar]
- ↑ «https://www.sigmaaldrich.com/ES/es/sds/aldrich/139742». Consultado el 31 de marzo de 2023.
- ↑ «https://www.cib.csic.es/sites/default/files/inline-files/Generalidades.pdf». Consultado el 31 de marzo de 2023.
- ↑ «https://digital.csic.es/bitstream/10261/23028/4/Granados_Carmen_4.pdf». Consultado el 30 de marzo de 2023.
- ↑ «https://febs.onlinelibrary.wiley.com/doi/epdf/10.1111/j.1432-1033.1967.tb00047.x». Consultado el 15 de marzo de 2023.
- ↑ «http://actachemscand.org/pdf/acta_vol_04_p0283-0293.pdf». Consultado el 15 de marzo de 2023.